Analyse génomique

Equipe

Resp. Scientifique. Judith Melki

Le plateau de génomique permet d’identifier de nouvelles causes génétiques de maladies humaines du système nerveux. Il permet de mettre en œuvre des technologies de génomique (séquençage d’exome entier, WES), suivies d’une analyse bioinformatique des données afin de sélectionner des variants, du séquençage Sanger pour les valider et analyser les conséquences fonctionnelles de ces variants par analyse des ARN et protéines puis par la génération de modèles cellulaires et/ou animaux.

Activités

1 et 2. Sélection de patients et séquençage d’exome entier (whole exome sequencing -WES

Grâce à la collaboration des médecins cliniciens et généticiens, nous sélectionnons des familles de patients avec une pathologie particulière. Ensuite, nous initions un séquençage d’exome entier (WES) de plusieurs patients (désormais réalisé sur des plateformes de séquençage haut débit).

Les WES sont effectués avec le kit Twist Bioscience Human Core Exome (Consensus CDS) pour la préparation des librairies et l’enrichissement des exomes (Integragen).

3. Analyse bioinformatique pour prédire des variants

L’analyse bioinformatique des données issues du séquençage est effectuée par notre groupe. Les séquences sont alignées au génome humain de référence via le programme BWA. Les variants sont ensuite sélectionnés et annotés avec les logiciels SAMtools et Annovar. Les variants localisés dans les régions codantes (incluant les missenses et nonsenses), les jonctions intron-exon (£10bp) ou les délétions ou duplications en phase sont sélectionnés quand leur fréquence dans la population générale est inférieure ou égale à 0,005 (avec les bases de données 1000G, ExAC, TopMed, GnomAD et ALFA). La prédiction de pathogénicité des variants missenses est réalisée avec les logiciels CADD, Polyphen-2 or Sift, des variants d’épissage avec le logiciel Human splicing finder et Clinvar pour les variants déjà répertoriés (NCBI).

4. Validation de variants par séquençage Sanger ou PCR-quantitative

Malgré des algorithmes de détection sophistiqués, l’analyse de séquençage d’exome entier (WES) peut entrainer des faux positifs. La méthode de référence pour identifier une nouvelle mutation repose sur le séquençage Sanger qui permet de valider un locus précis (avec un faible taux d’erreur <0,1 %). Les variants identifiés et sélectionnés sont validés par séquençage Sanger après amplification PCR (Eurofins Genomics). Les séquences obtenues sont ensuite comparées aux séquences de références (BLAST, NCBI). Le séquençage Sanger est aussi réalisé pour établir le génotype des membres de la famille afin d’établir la ségrégation des variants au sein de chaque famille. Quand des variants d’épissage ou des codons stop prématurés sont identifiés, l’analyse des ARN est effectuée pour valider l’effet délétère des variants sur l’épissage ou la stabilité des transcrits.

5 et 6. Validation fonctionnelle par analyse des ARN et des protéines et étude des mécanismes physiopathologiques liés aux nouveaux gènes

L’identification d’un nouveau gène est suivie de sa validation fonctionnelle effectuée par la génération et la caractérisation de modèles animaux (C. elegans ou poisson zèbre) ou cellulaires.

Accès

Les activités de ce plateau sont accessibles à des utilisateurs externes sur demande, en général dans le cadre de collaborations scientifiques.

Principales publications

Notre groupe a identifié 11 nouveaux gènes et mécanismes dans les 12 dernières années.

Ces gènes sont ASAH1 (Zhou et al. 2012), CNTNAP1 et ADCY6 (Laquérriere et al. 2014), MAGEL2 (Mejlachowicz et al. 2015), GLDN (Maluenda et al. 2016), LGI4 (Xue et al. 2017), UNC50 (Abiusi et al. 2017), EPHB4 (Vivanti et al. 2018), SCN1A (Jaber et al. 2021), NPR1 (Capri et al. 2023) et DST (Capri et al. 2023).

Zhou J, Tawk M, Tiziano FD, Veillet J, Bayes M, Nolent F, Garcia V, Servidei S, Bertini E, Castro-Giner F, Renda Y, Carpentier S, Andrieu-Abadie N, Gut I, Levade T, Topaloglu H, Melki J. Spinal Muscular Atrophy Associated with Progressive Myoclonic Epilepsy Is Caused by Mutations in ASAH1. Am J Hum Genet. 2012;91:5-14.       

Laquérriere A, Maluenda J, Camus A, Fontenas L, Dieterich K, Nolent F, Zhou J, Monnier N, Latour P, Gentil D, Héron D, Desguerres I, Landrieu P, Beneteau C, Delaporte B, Bellesme C, Baumann C, Capri Y, Goldenberg A, Lyonnet S, Bonneau D, Estournet B, Quijano-Roy S, Francannet C, Odent S, Saint-Frison Mh, Sigaudy S, Figarella-Branger D, Gelot A, Mussini Jm, Lacroix C, Drouin-Garraud V, Malinge Mc, Attié-Bitach T, Bessieres B, Bonniere M, Encha-Razavi F, Beaufrère Am, Khung-Savatovsky S, Perez Mj, Vasiljevic A, Mercier S, Roume J, Trestard L, Saugier-Veber P, Cordier Mp, Layet V, Legendre M, Vigouroux-Castera A, Lunardi J, Bayes M, Jouk Ps, Rigonnot L, Granier M, Sternberg D, Warszawski J, Gut I, Gonzales M, Tawk M, Melki J. Mutations in CNTNAP1 and ADCY6 are responsible for severe arthrogryposis multiplex congenital with axoglial defects. Hum Mol Genet. 2014;23:2279-89.

Mejlachowicz D, Nolent F, Maluenda J, Ranjatoelina-Randrianaivo H, Giuliano F, Gut I, Sternberg D, Laquerrière A, Melki J. Truncating Mutations of MAGEL2, a Gene within the Prader-Willi Locus, Are Responsible for Severe Arthrogryposis. Am J Hum Genet. 2015;97:616-620.

Maluenda J, Manso C, Quevarec L, Vivanti A, Marguet F, Gonzales M, Guimiot F, Petit F, Toutain A, Whalen S, Grigorescu R, Coeslier Ad, Gut M, Gut I, Laquerrière A, Devaux J, Melki J. Mutations in GLDN, Encoding Gliomedin, a Critical Component of the Nodes of Ranvier, Are Responsible for Lethal Arthrogryposis. Am J Hum Genet. 2016;99:928-933.

Xue S, Maluenda J, Marguet F, Shboul M, Quevarec L, Bonnard C, Ng Ay, Tohari S, Tan Tt, Kong Mk, Monaghan Kg, Cho Mt, Siskind Ce, Sampson Jb, Rocha Ct, Alkazaleh F, Gonzales M, Rigonnot L, Whalen S, Gut M, Gut I, Bucourt M, Venkatesh B, Laquerrière A, Reversade B, Melki J. Loss-of-Function Mutations in LGI4, a Secreted Ligand Involved in Schwann Cell Myelination, Are Responsible for Arthrogryposis Multiplex Congenita. Am J Hum Genet. 2017;100:659-665.

Abiusi E, D’alessandro M​, Dieterich K, Quevarec L, Valfort Ac, Mezin P, Jouk Ps, Gut M, Gut I, Bessereau Jl, Melki J. Biallelic mutation of UNC50, encoding a protein involved in AChR trafficking, is responsible for arthrogryposis. Hum Mol Genet. 2017;26:3989-3994.

Vivanti A, Ozanne A., Grondin C, Saliou G, Quevarec L, Maurey H, Aubourg P, Benachi A, Gut M, Gut I, Martinovic J, Sénat Mv, Tawk M, Melki J. Loss of function mutations in EPHB4 are responsible for vein of Galen aneurysmal malformation. Brain. 2018;141:979-988.

Jaber D, Gitiaux C, Blesson S, Marguet F, Buard D, Varela Salgado M, Kaminska A, Saada J, Fallet-Bianco C, Martinovic J, Laquerriere A, Melki J. De novo mutations of SCN1A are responsible for arthrogryposis broadening the SCN1A-related phenotypes. J Med Genet. 2021;58:737-742.

Laquerriere A, Jaber D, Abiusi E, Maluenda J, Mejlachowicz D, Vivanti A, Dieterich K, Stoeva R, Quevarec L, Nolent F, Biancalana V, Latour P, Sternberg D, Capri Y, Verloes A, Bessieres B, Loeuillet L, Attie-Bitach T, Martinovic J, Blesson S, Petit F, Beneteau C, Whalen S, Marguet F, Bouligand J, Heron D, Viot G, Amiel J, Amram D, Bellesme C, Bucourt M, Faivre L, Jouk Ps, Khung-Savatovsky S, Sigaudy S, Delezoide Al, Goldenberg A, Jacquemont Ml, Lambert L, Layet V, Lyonnet S, Munnich A, Van Maldergem L, Piard J, Guimiot F, Landrieu P, Letard P, Pelluard F, Perrin L, Saint-Frison Mh, Topaloglu H, Trestard L, Vincent-Delorme C, Amthor H, Barnerias C, Benachi A, Bieth E, Boucher E, Cormier-Daire V, Delahaye-Duriez A, Desguerre I, Eymard B, Francannet C, Grotto S, Lacombe D, Laffargue F, Legendre M, Martin-Coignard D, Megarbane A, Mercier S, Nizon M, Rigonnot L, Prieur F, Quelin C, Ranjatoelina-Randrianaivo H, Resta N, Toutain A, Verhelst H, Vincent M, Colin E, Fallet-Bianco C, Granier M, Grigorescu R, Saada J, Gonzales M, Guiochon-Mantel A, Bessereau Jl, Tawk M, Gut I, Gitiaux C, Melki J. Phenotypic spectrum and genomics of undiagnosed arthrogryposis multiplex congenita. J Med Genet. 2022;59:559-567.

Capri Y, Kwon T, Boyer O, Bourmance L, Testa N, Baudouin V, Bonnefoy R, Couderc A, Meziane C, Tournier-Lasserve E, Heidet L, Melki J. Biallelic NPR1 loss of function variants are responsible for neonatal systemic hypertension. J Med Genet. 2023;60:993-998.

Capri Y, Bourmance L, Dupont C, Saint-Frison Mh, Guimiot F, Grotto S, Chitrit Y, Laquerrière A, Melki J. DST variants are responsible for neurogenic arthrogryposis multiplex congenita enlarging the spectrum of type VI hereditary sensory autonomic neuropathy. Clin Genet. 2023;104:587-592.

Les noms en caractères gras sont les membres de notre laboratoire